菌種保藏是指保持微生物菌株的活力和遺傳性狀的技術。微生物在使用和傳代過程中容易發生污染、變異甚至死亡,因而常常造成菌種的衰退。菌種保藏的目的就是使菌株存活、不丟失、不污染雜菌、不發生或少發生變異,保持菌種原有的活性和各種特征。菌種保藏的基本原理是使微生物的生命活動處于半永jiu性的休眠狀態,也就是將微生物的新陳代謝作用限制在最di范圍內。
實驗室常用的保菌方法有:甘油保菌法、斜面保菌法、穿刺保菌法、液體石蠟覆蓋保藏法、沙土保藏法、冷凍干燥法。微基生物在以上幾種菌種保藏方法的基礎上,開發出了保菌效果更好瓷珠保菌法。
一、甘油保菌法
此方法適用于菌種的中長期保藏,保藏時間可在1年以上。由于甘油本身十分粘稠,很難定量,因此一般將甘油和生理鹽水按1:1的比例配成終濃度為50%的甘油溶液。使用時,按50%甘油:菌液=1:1的比例混合,使甘油終濃度在20-30%即可,甘油濃度過高或過低都不利于菌種保藏。將甘油菌種轉移至-80℃冰箱長期凍存。需要取用菌種的時候,將凍存管放在37℃水浴中快速解凍,直到菌種wan全融化,此時可取出菌種進行實驗。
此方法適用范圍廣,操作簡單,保藏期長,菌種不容易發生變異。
二、斜面保菌法
將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上,待菌充分生長后轉移至4℃冰箱中保藏。保藏的時間根據微生物的種類而不同,一般霉菌、放線菌及產芽孢的細菌保存2-4個月就需要移種一次,酵母菌為兩個月,而細菌最好一個月移種一次。需要取用菌種的時候,可用接種環在斜面上挑取少量菌體進行接種。
此方法的優點是操作簡單,使用方便,不需特殊設備,能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異或污染雜菌等。缺點是保藏期短,菌種容易變異,因為培養基的物理和化學性質不是嚴格恒定的,屢次傳代會使微生物的代謝發生改變,且此方法污染雜菌的機會較高。
三、穿刺保菌法
準備一管半固體培養基,用接種針挑取菌種,自半固體培養基的中心垂直刺入,直至接近試管底部,但不要穿透,然后沿原穿刺線將接種針退出,于4℃冰箱保存。此方法同斜面保菌法一樣需要定期移種。
四、液體石蠟覆蓋保藏法
此方法是斜面保菌的輔助方法。將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上,待菌充分生長后注入無菌液體石蠟,使其覆蓋整個斜面,再直立放置在4℃冰箱中保藏。液體石蠟可防止因培養基水分蒸發而引起菌種死亡,同時可以讓菌體與空氣隔絕,減弱菌種的代謝作用,延長保藏時間。需要取用菌種時,用接種環從斜面上挑取少量菌種即可。
此方法的優點是操作簡單,不需要特殊的設備,且不需要頻繁移種,保藏時間較長。缺點是保存時必須直立放置,占用空間較大。
五、沙土保藏法
將培養好的菌種與無菌沙土混合,使菌體吸附在沙土載體上,干燥后轉移至4℃冰箱保存。需要取用菌種的時候,取出少量沙土顆粒即可。
此方法操作簡單,菌種的保藏時間長。
六、冷凍干燥法
將菌種冷凍,在減壓下利用升華作用去除水分,使細胞的生理活動趨于停止,從而使菌種長期維持存活的狀態。需要取用菌種的時候,用無菌水或培養基重懸菌體,將菌懸液轉移至固體培養基平板上進行培養。
此方法適用于菌體的長期保存,但是相關的設備和操作相對其他幾種保藏方法都比較復雜。
七、瓷珠保菌法
微基生物在以上幾種保藏方法的基礎上開發出了瓷珠保菌法,相對傳統的保藏方法保菌的效果更好,而且取用方便,可降低菌種因反復凍融而受到的傷害。
瓷珠凍存管中包含12顆磨砂瓷珠和菌種保存液。挑取對數生長期的菌種轉移至凍存管中,上下顛倒混勻,此時菌種會均勻分布在保存液中。用移液器吸出保存液,此時在表面張力的作用下,每顆瓷珠表面都會覆蓋一層保存液,而菌種就保存在這層保存液中。將含有菌種的凍存管轉移至-80℃冰箱即可長期凍存(一般可保存約1年)。
需要取用菌種時,從-80℃冰箱中取出凍存管,輕輕搖晃使瓷珠分散開,挑取一顆瓷珠接種至培養基平板上進行劃線培養,或接種至液體培養基中進行搖菌培養。接種完成后,迅速將凍存管放回冰箱中。
針對厭氧菌株,我們也能夠提供含有還原劑的厭氧性保存液,并對菌種采用真空包裝,避免菌種因接觸氧氣而死亡。
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