谷氨酸(glutamic acid，Glu)含量測定試劑盒說明書

                                 微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

Glu廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，不僅是組成蛋白質的20種氨基酸之一，而且通過轉氨基作用參與多種氨基酸合成，是生物體內主要氨基來源之一。此外，Glu還是味精的主要有效成分，常用做食品添加劑以及香料生產。

測定原理：

利用專用提取液提取，然后用顯色劑進行顯色，顯色后在570nm下進行測定。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶， 4℃保存；臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解混勻，用不完的試劑仍 4℃保存。

谷氨酸提取：

1、細菌或培養細胞樣品：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 常溫離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織樣品：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 常溫離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）或細胞培養液樣品：按照血清（漿）或細胞培養液體積（mL）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）或者細胞培養液加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 常溫離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至570nm，蒸餾水調零。

2、   在有蓋EP管中加入下列試劑：

混勻，90℃水浴20min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，于570nm波長處記錄吸光值A。△A=A測定管-A對照管。對照管只要做一管。

谷氨酸含量計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸方程為y = 0.0074x- 0.5255；x為谷氨酸含量（µg/mL），y為吸光值。

2、按照血清（漿）或者細胞培養液體積計算

谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2）=1351×(△A+0.5255)

3、按照蛋白濃度計算

谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr

4、按照樣本質量計算

谷氨酸含量(µg/g鮮重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W ×V1÷V2)=135.1×(△A+0.5255) ÷W

5、按照細菌或細胞密度計算

谷氨酸含量(μg/10⁴ cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(500×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)

V1：加入反應體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）或細胞培養液體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸方程為y = 0.0037x- 0.5255； x為谷氨酸含量（µg/mL），y為吸光值。

2、按照血清（漿）或者細胞培養液體積計算

谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0037×V1]÷(V3×V1÷V2）=2703×(△A+0.5255)

3、按照蛋白濃度計算

谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(V1×Cpr)=270.3×(△A+0.5255) ÷Cpr

4、按照樣本質量計算

谷氨酸含量(µg/g鮮重)= [(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(W ×V1÷V2)=270.3×(△A+0.5255) ÷W

5、按照細菌或細胞密度計算

谷氨酸含量(μg/10⁴ cell)=[(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(500×V1÷V2)=0.541×(△A+0.5255)

V1：加入反應體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）或細胞培養液體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

注 意：

1、該試劑盒僅適用于發酵液或組織中谷氨酸含量測定，檢測下限為100µg/mL。

2、標準曲線線性范圍為：100µg/mL -600µg/mL。

3、ΔA線性范圍為：0.01-1；若大于1則需要將上清液用試劑一稀釋至適當倍數后測定，計算公式中乘以相應稀釋倍數。